استخراج DNA
استخراج DNA : روش CTAB
ما از این روش برای استخراج کردن توالی ژنوم با کیفیت (برای نمونه؛ برش داده نشده) استفاده کردیم، DNA که بتوان از آن برای آرشیوه های درج بزرگ استفاده نمود. از آن برای استخراج مواد برای پروژه توالی ژنوم کامل میکروموناس [1]RCC299، و پروژه توالی ژنوم میکروموناس RCC472[2] استفاده کردیم. این پروتکل ابتدا توسط اولین دریل[3] از ابزرواتیور اوشنولوژیگ، بانیولس سر مر[4] به ما داده شد. این کار از واینپنینکس بی. و همکاران[5]، 1993، تی آی چی جلد 9، شماره 2، صفحه 407 (نکات تکنیکی) اتخاذ شده است.
مشکلات بالقوه این پروتکل: از مرحله فنولی استفاده نمی شود – این می تواند منجر به آلودگی پروتئینی بالاتری نسبت به سطح مورد نظر گردد (گرچه ما در این رابطه مشکلی نداشتیم).
ما از پلاستیک ها و نوک های آزاد DNAse/RNase مجوز دار استفاده کردیم – نوک ها از نوع مقاوم به آئروسل هستند.
برداشت سلول
سلول های میکروموناس از بیشتر از 700 میلی لیتر کشت توسط سانتریفیوژ دو مرحله ای در دور 4500 تا 8000 به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد جداسازی و برداشت شدند. ابتدا لوله های سانتریفیوژ استریل 85-50 میلی لیتری چرخانده شده، بیشتر مایع جمع شده در روی آن برداشته شد، و سپس مابقی آن با پیپت در لوله های 7/1 میلی لیتری ریخته شد؛ مجدداً تکان داده شده و سر ریز آن دوباره دور ریخته شد (کل آن). این دانه های سلول سپس در دمای 80 درجه سلسیوس زیر صفر نگهداری شدند یا بلافاصله به صورت زیر پردازش شدند.
استخراج DNA
سلول ها مجدداً در 8/0 میلی لیتر از بافر استخراج CTAB از پیش گرم شده (60 درجه سانتیگراد) سوسپانسیون گردید.
بافر CTAB:
2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide) 100 mM TrisHCl [pH=8]
20 mM EDTA,
1.4 M NaCl
0.2% b-mercaptoethanol [بلافاصله قبل از استفاده اضافه گردید]
0.1 mg/mL proteinase K [بلافاصله قبل از استفاده اضافه گردید])
و سپس در دمای 60 درجه سانتیگراد به مدت یک ساعت گرمخانه گذاری (انکوبه) شدند. ما ماده معرف را در 18.2 MΩ H2O استریل (برای نمونه میلیک یا نانوپور[6]) آماده کردیم و با فیلتر (محلول از میان فیلتر 2/0 میکرومتری در یک سرنگ استریل رد گردید) محلول را استریل کردیم (قبل از اضافه کردن بتا –مرکاپتو پروکی[7]).
به آرامی به صورت برعکس کردن ریز لوله (میکروتیوب) گاه به گاه محلول را مخلوط کردیم.
پس از گذشت یک ساعت، 8/0 میلی لیتر کلروفرم / ایروآمیل الکل (با نسبت 24 به 1) به محلول اضافه کردیم. در هود دود کار کردیم.
به آرامی محلول را به مدت 2 دقیقه با چرخاندن لوله مخلوط کردیم.
با سرعت (14000 دور) در دمای 4 درجه سلسیوس آن را به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کردیم.
به دقت فاز آبی (محلول بالای لایه واسط سفید رنگ) را به یک میکروتیوب تمیز منتقل کردیم (مابقی آن سپس دور ریخته شد). برای انجام سریعتر این کار (قبل از کاهش واسط)، یک پیپت 1000 را با نوک روی آن آماده کرده و نوک پی 200 روی آن گذاشتیم (که از کنار میز آویزان بود، چرا که هرگز نباید محلول را پس از این مرحله لمس کنید، به خاطر مقاصد و دلایل ایمنی و خطرات شیمیایی). حجم بیشتری را با سمپلر 1000 برداشته و سپس به آرامی با سمپلر 200 به حد واسط محلول و رسوب نزدیک شدیم (با محافظه کاری و نه خیلی نزدیک که رسوب و محلول رویی مخلوط شوند).
یک میکرولیتر از (RNase (عاری از DNase) ) را به آن اضافه کرده و به مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه گرمخانه گذاری کردیم. مواظب باشید که کجا این کار را انجام می دهید. اگر کار شما با RNA در آزمایشگاه انجام می شود، سعی کنید که به طور فیزیکی این سطوح، پیپت های استفاده شده و سایر وسایل استفاده شده را از هم جدا نگهداری کندی.
6/0 میلی لیتر از ایزوپروپانول (دو سوم حج محلول جداسازی شده) را اضافه کردیم. به آرامی میکروتیوب را تکان داده تا کاملاً مخلوط شود. رسوب داخل آن را به مدت 2 ساعت تا یک شب در دمای اتاق رها کرده تا امکان تشکیل «ژله DNA» فراهم آید (واقعاً! خیلی جالب به نظر می رسه).
به مدت 15 دقیقه با دور 14000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا دانه های DNA جدا شوند (زمانی که لوله ها را در داخل سانتریفیوژ قرار می دهید، بهتر است که به صورت مسیری انجام دهید – طوری که بدانید کجای لوله دنبال این دانه ها بگردید).
به دقت سر ریز مخلوط را جدا کرده، سپس دانه را یک یا دو بار با EtOH سرد بشوئید، برای مثال
ما یکبار در EtOH هفتاد درصد یا 1x in 76% EtOH/10 mM AcNH4 انجام دادیم و دفعه دوم با 1x70% EtOH شستیم.
با بالاترین سرعت به مدت 15 دقیقه و دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ کنید.
سرریز آن را دو ریخته و دانه ها را با باز نگه داشتن لوله خشک کنید در یخچال
دانه ها را مجدداً با آب مقطر استریل یا TE مخلوط کنید (ما از TE با اسیدیته 8 استفاده کردیم)، نیمی از آن برداشته و در دمای 20 درجه سانتیگراد زیر صفر نگهداری کنید.
مثالی از کیفیت DNA حاصله
در زیر یک نمونه از DNA استخراج شده با این روش آمده است – ژل نشان داده شده در 1% آگاروز ژل مرطوب w/ HINDIII digest of l (0.5 mg loaded)، یک میکرولیتر از نمونه بارگذاری شده گرفته شده است.
عدسی های 2 و 6 یک کیلوبایت به علاوه نردبان گذاشته شده است
خط 3 نمونه DNA میکروموناس RCC299 است، خط 4 نمونه RCC299 در نمونه B می باشد. خط 5 شاهد lHINDIII است.
اطلاعات سفارش مواد شیمیایی مورد استفاده (http://www.tarjomac.com/)
Ordering info for chemicals used
معرف |
فروشنده |
شماره کاتالوگ |
CTAB |
Sigma |
H6269 |
Chloroform |
Sigma |
C2432 |
Isoamyl alchohol |
Sigma |
I9392 |
Isopropyl alcohol |
VWR |
PX-183514 |
Rnase (100mg/ml Dnase free) |
Qiagen |
19101 |
TE (10 mM tris, 1mM EDTA) |
Ambion |
9858 |
Proteinase K |
Qiagen |
19131 |
NaCl |
Sigma |
S3014 |
b-Mercaptoethanol |
Sigma |
M3148 |
Ammonium acetate |
Sigma |
A1542 |
برای دریافت منابع با ترجمک تماس بگیرید (کد مقاله: 110013).
tarjomac.com
